Lactiplantibacillus plantarum L67에 의한 3T3-L1 지방세포 분화 및 지방 축적 조절

3T3-L1 지방전구세포는 10% Bovine calf serum(Gibco, USA)과 1% penicillin/streptomycin(Gibco)이 포함된 DMEM(WELGENE, Korea) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 유도하기 위해 confluent 상태에서 2일 후 5% Fetal bovine serum(Gibco)와 1% penicillin/streptomycin을 포함한 DMEM(5% FBS DMEM)에 250 μM IBMX, 250 nM Dexamethasone 및 5 μg/mL insulin를 혼합한 분화유도 배지로 교체하였다(day 0). 이후 2일 간격으로 day 2와 day 4에 5% FBS DMEM에 5 μg/mL insulin을 혼합한 분화 유지 배지를 처리하였다. L67 균주는 MRS broth(BD Difco, USA)를 사용하여 37℃ 조건에서 24시간 배양 후 4,000×g에서 15분간 원심분리 후 상등액만 분리하여 L67 조건 배지(L67-CM)로 사용하였다. L67-CM은 3T3-L1 배양배지에 1/100 희석비율로 희석하여 48시간 간격으로 처리하였다.

3T3-L1 지방세포에서 RiboEX^™(GeneAll, Korea)를 사용하여 total RNA 회수 후 MMLV-RTase (Promega, USA)와 Oligo dT primer(Promega)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT-qPCR은 이전 연구와 동일한 방법대로 수행하였으며[10], 결과값은 36B4 발현을 기준으로 대조하여 분석하였다. PCR product의 상대적 정량은 2^–ΔΔCt 방법을 이용하여 타겟 유전자와 36B4 유전자의 Ct 값의 차이로 계산되었다. 프라이머의 서열은 Table 1과 같다.

Day 6 3T3-L1 지방세포를 10% formalin에서 1시간 동안 고정시킨 후 60% isopropanol로 washing 하였다. 이후 Oil red O staining solution을 사용하여 10분간 염색 후 증류수로 washing 하여 Biotek Cytation 5(Agilent, USA)를 사용하여 관찰하였다. Oil red O 염색의 정량을 위해 isopropanol을 사용하여 3T3-L1 지방세포에 염색된 Oil red O 염색시약을 추출 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Day 6 3T3-L1 지방세포를 5% NP-40 solution을 사용하여 회수 후 80℃–100℃에서 5분간 가열하여 세포 내 중성지방을 용해하였다. 중성지방 함량은 TG quantification kit(SCG Biomax, Korea)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

실험결과의 통계적 유의성은 Student’s t-test에 의해 얻어졌다. 실험 결과는 평균±표준 편차로 나타내었다. 모든 실험은 최소 3회 반복으로 수행되었다.

이전의 연구에서 고지방식이(high-fat diet, HFD) 유도 비만 마우스에 L67의 경구투여는 고지방식이에 의한 체중 증가 감소와 간 및 지방조직에서의 지질축적 및 인슐린 저항성 개선 효과를 가지는 것으로 확인되었다[7]. 특히 분화가 완료된 성숙된 지방세포에 L67-CM의 처리할 경우, 지방 축적을 억제하는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는, 지방세포 분화 과정에서 유도되는 지방 축적에 L67이 미치는 영향을 조사하기 위해 3T3-L1 지방세포의 분화 과정 동안 L67-CM을 처리하여 Oil red O 염색을 통해 지방 축적 변화를 비교하였다. L67-CM을 각각 분화 전 3T3-L1 지방전구세포(pre), 지방세포 분화유도시작점(D0), 분화유도 2일차(D2) 그리고 4일차(D4)에 48시간 간격으로 처리를 시작하여 3T3-L1 지방세포 분화 종료시점(D6)에 Oil red O 염색을 실행하였다. Fig. 1에서 나타난 바와 같이, L67-CM을 처리하지 않은 대조군 3T3-L1 지방세포(non)와 비교하여 pre, D0, D2 그리고 D4 시점에 L67-CM을 처리를 시작한 3T3-L1 지방세포에서는 처리시작점에 따라 지방 축적이 50%–75% 감소하였다. 또한 분화과정 중 L67-CM을 처리한 시점이 빠를수록 더 높은 지방 축적 감소 효과를 보이는 것으로 나타났다. 이러한 연구결과는 고지방식이에 의해 유도되는 비만에 대한 L67의 억제 효과는 기존 지방세포의 에너지대사 촉진뿐 아니라 비만환경에서 촉진되는 지방세포 분화에 따른 지방세포의 수 및 크기 증가 억제를 통해 지방조직 내 과도한 지질 축적을 억제할 가능성을 제시한다.

Fig. 1. The effect of L67 on the lipid accumulation in 3T3-L1 during adipogenesis. L67-CM was added to 3T3-L1 preadipocytes at the indicated time points (preadipocytes, pre; 0, 2, and 4 days after differentiation, D0, D2, and D4, respectively) during adipocyte differentiation and then, cells were differentiated in the absence (vehicle, non) or presence of L67-CM, as indicated. Oil red O staining of 3T3-L1 adipocytes was performed on day 6 of differentiation. Lipid accumulation was determined by measuring absorbance at 490 nm. Scale bars, 200 μm. All data are presented as the mean value±SEM from three independent experiments (n=3). ^***p<0.01 (vs. non).

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성숙한3T3-L1 지방세포에서 L67-CM의 처리는 L67 경구투여 쥐의 지방조직에서와 마찬가지로 지방합성의 주요 유전자를 억제하고 지방산산화, 지방분해 및 에너지대사의 주요 유전자 발현은 증가시키는 것으로 나타났다[7]. L67이 3T3-L1 지방전구세포의 분화과정에서 지방 축적을 억제하였으므로, 지방세포 분화과정 중 분화 및 지방 축적에 관련된 주요 조절자의 유전자 발현을 확인하기 위해 L67-CM을 각각 분화 전 3T3-L1 지방전구세포(pre), 지방세포 분화유도시작점(D0), 분화유도 2일차(D2) 그리고 4일차(D4)에 48시간 간격으로 처리를 시작하여 3T3-L1 지방세포 분화 종료시점(D6)에 RT-qPCR을 진행하였다. 지방세포 분화과정의 중기 및 후기를 조절하는 C/EBPα 와 PPARγ의 유전자 발현은 각 시점에서의 L67-CM 처리에 의해 대조군 3T3-L1 지방세포(non)와 비교하여 각각 65%–92%, 44%–94% 감소하였다(Fig. 2). 마찬가지로 지방세포 분화과정 후기에 PPARγ에 의해 유도되는 aP2의 유전자 발현은 L67-CM을 처리할 경우, 대조군 3T3-L1 지방세포(non)에 비해 70%–98% 감소됨을 확인하였다. 또한 지방세포 분화과정 동안 지질생합성의 핵심 조절자인 SREBP-1c와 FAS 유전자 발현의 경우, L67-CM 처리에 의해 대조군 3T3-L1 지방세포(non) 대비 각각 46%–89%, 17%–81% 감소하는 것으로 나타났다. L67에 의한 지방세포 분화 및 지질합성에 관련된 핵심 유전자들 발현에 대한 본 결과는 지방세포 분화과정 동안 L67처리에 의한 지방 축적 억제하는 것과 일치하는 결과로, L67은 C/EBPα, PPARγ 및 aP2와 같은 지방세포 분화 과정의 핵심 조절자의 발현 조절을 통해 지방세포 분화를 억제하고, SREBP-1c 및 FAS의 발현을 조절하여 지질생합성 및 지방적의 형성 및 축적을 저해할 가능성이 있는 것으로 확인되었다.

Fig. 2. The effect of L67-CM on the expression of genes involved in adipogenesis and lipogenesis in 3T3-L1 adipocytes during differentiation. L67-CM was added to 3T3-L1 preadipocytes at the indicated time points (preadipocytes, pre; 0, 2, and 4 days after differentiation, D0, D2 and D4, respectively) during adipocyte differentiation and then, cells were differentiated in the absence (Vehicle, non) or presence of L67-CM, as indicated. Gene expression in 3T3-L1 adipocytes was determined by RT-qPCR on Day 6 of differentiation. All data are presented as the mean value±SEM from three independent experiments (n=3). ^*p<0.05 (vs. non), ^***p<0.01 (vs. non).

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이전의 연구에서 L67의 경구투여는 고지방식이 마우스의 혈중 중성지방 함량 및 지방조직의 중성지방 함량을 낮추는 것으로 확인되었으며, 3T3-L1 지방세포에서 L67-CM에 의해 세포 내 중성지방 함량이 감소하는 것으로 나타났다[7]. 성숙한 지방세포는 분화 과정에서 합성되는 지방산에 의해 생성된 중성지방을 지방적 형태로 저장하는 역할을 하며, 3T3-L1 지방세포 분화 과정에 참여하는 주요 조절자의 유전자 발현 조절 및 분화과정 중 지방 축적에 대한 L67-CM의 억제 효과를 확인하였으므로, L67이 세포 내 중성지방 함량에 영향을 주는 지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방세포 분화 과정 동안 L67-CM을 처리 후 중성지방 함량을 측정하였다. 실험 결과, L67-CM 처리 시점에 따라, 대조군 3T3-L1 지방세포(non)와 비교하여 세포 내 중성지방함량이 pre, D0, D2 및 D4 조건에서 각각 71%, 53%, 35%, 23% 감소하였다(Fig. 3). 이 결과는 Fig. 1의 Oil red O 염색 결과와 더불어, Fig. 2에서 보여진 L67-CM에 의한 각 유전자들의 발현 변화가 실질적인 중성지방 축적 저해로 이어졌음을 제시한다. L67-CM에 의해 발현 감소가 확인된 SREBP-1c의 경우 AMPK 또는 PKA에 의한 인산화로 활성이 억제되는 것이 알려져 있으며, PPARγ의 경우 AMPK-SIRT1에 의한 전사활성 조절이 알려져 있고, 특히 이전 우리의 연구에서 Lactobacillus sp.에 의해 고지방식이 마우스의 대사조직에서 AMPK-SIRT1 또는 PKA의 활성이 촉진되는 것이 밝혀졌으므로, 이러한 인산화 및 탈아세틸화 효소에 의해 L67의 지방세포 분화과정 억제 효과가 매개될 가능성이 있다[8,10,12–14]. 본 연구에서는 L67이 3T3-L1 지방세포에서 지방 축적, 주요 유전자 발현 및 세포 내 중성지방을 조절하여 지방세포 분화를 억제함을 in vitro 수준에서 검증하였다. 이러한 결과는 단일 세포주 기반의 실험으로, 향후 다양한 지방세포주 및 동물 모델에서의 검증이 필요하다. 또한 이전의 연구를 바탕으로, L67에 의한 지방세포 분화의 주요 유전자 발현 조절에 대한 전사 수준의 메커니즘과 이를 조절하는 신호 전달 경로에 대한 연구를 추가적으로 실시할 수 있다.

Fig. 3. L67-CM treatment during adipocyte differentiation reduced intracellular triglyceride levels in 3T3-L1 adipocytes. L67-CM was added to 3T3-L1 preadipocytes at the indicated time points (preadipocytes, pre; 0, 2, and 4 days after differentiation, D0, D2, and D4, respectively) during adipocyte differentiation and then, cells were differentiated in the absence (vehicle, non) or presence of L67-CM, as indicated. On day 6 of differentiation, intracellular triglyceride levels were measured in 3T3-L1 adipocytes using TG quantification kit as described in “the materials and methods”. All data are presented as the mean value±SEM from three independent experiments (n=3). ^*p<0.05 (vs. non), ^***p<0.01 (vs. non).

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종합적으로, L67은 지방세포 분화 및 지질 생합성에 참여하는 각 전사 인자의 유전자 발현 뿐만 아니라 전사 활성 조절을 통해 하위 유전자 전사조절을 기반으로 지질분해, 지방산산화, 열생성 반응 등의 다양한 지질 대사를 조절할 가능성을 제시한다.